Gold逆转录酶
Gold逆转录酶
货号/规格：R3001/2,000U, R3002/10,000U
产品简介
Gold逆转录酶是通过基因重组技术改造M-MLV得到的耐热逆转录酶，具有更高的热稳定性，可在 37℃-55℃条件下合成第一链cDNA。同时该酶去除了RNaseH 活性，对于常见的逆转录反应抑制剂具有较高的耐受度，cDNA合成能力更强，可用于复杂二级结构的RNA逆转录，能够合成较长的cDNA 以及构建高比例的全长cDNA文库等。
产品组成
Component | R3001 (2,000U) | R3002 (10,000U) |
Gold逆转录酶（200U/μl） | 10 μl | 50 μl |
5X Gold Buffer | 100 μl | 500 μl |
活性定义
以Poly (rA)·Oligo (dT)为模板/引物，在37℃，10 min条件下，使1 nmol的dTTP掺入酸性沉淀物质所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
保存条件
-30~-15℃保存。
应用举例
第一链cDNA合成
1. 配制反应体系
按以下体系于RNase-free的离心管中配制逆转录反应液：
Component | Amount | Final Conc. |
Oligo (dT)15 Primer (50 µM) [1] or Random Primer (100 µM) [1] or 特异性引物 (2 µM) [1] | 1 μl | 2.5 µM |
5 µM | ||
0.1 µM | ||
Total RNA [2] or Poly A+ RNA [2] | 10 pg ~ 1 µg 10 pg ~ 100 ng | 0.5 pg ~ 50 ng/μl |
0.5 pg ~ 5 ng/μl | ||
5X Gold Buffer | 4 μl | 1X |
dNTP Mix (10 mM each) | 1 μl | 0.5 mM |
Gold 逆转录酶 (200 U/µl) | 1 μl | 10 U/μl |
RNase inhibitor (40 U/µl) | 1 μl | 2 U/μl |
RNase-free ddH2O | to 20 μl | - |
[1] 请根据实验需要选择合适的引物：Oligo dT引物仅转录mRNA，Random Primer可转录所有类型的RNA，特异性引物仅转录特异的RNA片段。当后续实验为qPCR时，建议混合使用Oligo dT和Random Primer各1 μl，提高定量结果的准确性。
[2] 若产物后续进行PCR反应，则建议先对模板RNA进行变性处理打开二级结构，有助于提高逆转录产物的产量。配置以下反应体系，于65℃加热5 min，再置于冰上迅速冷却2 min：
Component | Amount |
Total RNA or Poly A+ RNA | 10 pg ~ 5 μg 10 pg ~ 500 ng |
RNase-free ddH2O | to 10 μl |
2. 设定程序进行逆转录反应
将上述混合物充分混匀后按以下条件进行逆转录反应：
Temperature | 后续为PCR反应 | 后续为qPCR反应 |
Time | ||
25℃ [1] | 5 min | / |
37℃ [2] | 45 min | 15 min |
85℃ | 5 sec | 5 sec |
[1] 仅当使用Random Primer时需要此步，当使用Oligo (dT)15 Primer或特异性引物时无需进行此步。
[2] 当模板RNA具有复杂的二级结构或者高GC含量时，可将温度提高至50℃。
产物可立即进行PCR、qPCR反应，或保存于-20℃及以下环境中，并避免反复冻融。
注意事项
1. 请使用高质量的RNA，保证逆转录反应的效率
2. 在逆转录反应中注意防止RNase污染
本品仅供科学研究使用。
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