实验方案分享：针对猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的定性实时聚合酶链反应（Real-time PCR）检测

栏目：技术分享发布时间：2024-07-01

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix 实验方案 1

针对猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）的定性实时聚合酶链反应（Real-time PCR）检测：

1. 研究背景与目的

- 猴痘病毒（MPXV）是正痘病毒属（Orthopoxvirus, OPXV）的一种，自天花根除以来，已成为由OPXV引起的最严重疾病。

- 2022年全球猴痘疫情的爆发促使需要增加临床测试的诊断能力。

- 研究目的是验证一种定性的OPXV实时PCR检测方法，并描述其在临床实验室诊断MPXV的分析性能。

2. 材料与方法

2.1 分析性能实验材料

- 使用含有合成MPXV DNA的通用转运介质（UTM）或病毒转运介质（VTM）进行实验。

2.2 DNA提取

- 使用核酸提取仪器进行自动化核酸提取。

2.3 实时TaqMan PCR检测

- 总反应体积：20 µL（包含5 µL的模板和15 µL的主混合液）。

- 主混合液成分：

- 5 µL DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix （GDSBio, V5005）。

- 7 µL dH2O。

- 1 µL 正向引物（10 nm）。

- 1 µL 反向引物（10 nm）。

- 1 µL 探针（5 nm），针对OPXV目标序列。

- 临床样本测试：当加入内控时，dH2O的体积减少至4 µL，以允许加入1 µL的正向和反向引物（各10 nm）和探针（5 nm），针对人类RNAseP基因。

- 实时PCR操作：使用Prism 7500序列检测系统（Applied Biosystems），并按照以下循环条件进行：

- 1个循环：95.0°C持续2分钟。

- 40个循环：95.0°C持续3秒，60.0°C持续31秒。

在这项实验中，实时PCR是用来检测和定量猴痘病毒DNA的。使用的TaqMan化学方法是一种常用的荧光定量PCR技术，它可以在PCR扩增过程中实时监测DNA的累积量。通过这种方式，可以准确测定病毒DNA的浓度，从而帮助诊断猴痘病毒感染。

以下是实验中使用的引物和探针序列：

1. OPXV目标的引物和探针序列：

- 正向引物(F): `TCAACTGAAAAGGCCATCTATGA`

- 反向引物(R): `GAGTATAGAGCACTATTTCTAAATCCCA`

- 探针(P): `FAM-CCATGCAATATACGTACAAGATAGTAGCCAAC`

2. 人类RNAseP基因作为内控的引物和探针序列：

- 正向引物(F): `AGATTTGGACCTGCGAGCG`

- 反向引物(R): `GAGCGGCTGTCTCCACAAGT`

- 探针(P): `Cy5–TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG`

3. 首月测试中得到的阳性患者样本也在内部使用基于研究的猴痘特异性PCR进行了检测，使用的引物和探针序列（针对B6R基因）：

- 正向引物(F): `ATTGGTCATTATTTTTGTCACAGGAACA`

- 反向引物(R): `AATGGCGTTGACAATTATGGGTG`

- 探针(P): `FAM-AGAGATTAGAAATA`

2.4 检测限（LOD）

- 通过将MPXV DNA稀释至不同浓度并检测，确定LOD。

2.5 可重复性

- 使用100个拷贝/mL的MPXV阳性样本和阴性UTM/VTM评估可重复性。

2.6 特异性

- 测试已知阳性患者样本，包括单纯疱疹病毒1型、2型等，以确定特异性。

2.7 一致性

- 使用88个盲样（包括阴性和不同浓度的阳性样本）进行测试。

这个实验方案详细地描述了从样本收集、核酸提取、实时PCR检测到结果分析的全过程。

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix

货号：V5005，V5006

产品简介

DSPath 4X One-Step Multiplex Master Mix是用于一步法多重荧光定量PCR的试剂。它以探针和特异性引物来定量检测RNA或DNA靶标序列。优化的缓冲液组分可以协助在一个体系内完成多达4个RNA或DNA序列的多重定量PCR。该混合液以4倍浓度提供，能够加入更多的模板进行反应，从而提高检测的灵敏度。